حقیقت اینکه برای یک ارائه در درس ژنتیک2 آماده میشم وموضوع تحقیقی من هم QPCR یا Real-Time PCR هستش که یک روش بسیار جالب وکار آمد نسبت به روش PCR سنتی هست. لازم دیدم تا مطالبمو اینجاهم بنویسم شاید کسی بتونه استفاده کنه!
وجه افتراق Real Time PCR با PCR نوع معمولی به کار گرفتن یک نشانگر
فلورسنت در واکنش جهت ردیابی محصول واکنش می باشد. این گزارش‌گرها به
گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر DNA نور تولید کنند. لذا افزایش
شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. به
اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه (Threshold)باشد چرخۀ
آستانه یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی داری دارد و
از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد. به عبارت دیگر در فاز
اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانهای می رسد
که به مقدارمشخصی از سطح background بالاتر است، این چرخه ( سیکلی از PCR
که قطعه تکثیر از حد آستانه عبور می کند) به عنوان CT شناخته می شود.
برای درج نمودار تشعشعات فلورسنس یا به وسیله ی رنگ هایی مثل SYBER GREEN ویا پروب های DNA مثل TAQMAN که هر کدام به شیوه های مختلف به DNA ,CDNA وRNA متصل می شوند استفاده می گردد.
مزایای Real-Time PCR
* تکثیر می‌تواند در زمان- واقعی مانتیور شود.
* محصول PCR نیاز به پردازش های بعدی ندارد (ظرفیت پذیرش بالا و ریسک آلودگی پایینی دارد).
* چرخه‌های بسیار سریع (30 دقیقه تا 2 ساعت)
* محدوده پویایی آن1010 برابر بوده و نسبت به روش‌های سنجش سنتی RT-PCR (که 1000 برابر است) وسیع تر است.
* تشخیص با مقدار 2 برابر کمتر قابل انجام است.
* اثبات تکثیر مشخص از طریق آنالیز منحنی ذوب قابل انجام است.
* بسیار اختصاصی، حساس و تکرارپذیر است.
* نسبت به PCR سنتی زیاد گران‌تر از آب در نمی‌آید (البته به جزء قیمت دستگاه و تجهیزات آن)
معایب Real-Time PCR
* برای تکثیر چندتایی Multiplex PCR ایده‌آل نیست.
* نیاز به مهارت‌های تکنیکی و پشتیبانی قابل توجهی دارد.
* دستگاه و تجهیزات آن گران قیمت هستند.
* مشکلات مربوط به RNA
* تفاوت‌های سنجشی
* آلودگی DNA (در آنالیز mRNA)
Daniel J.Park , PCR Protocols
Harry W.Janes ,Bing-Yuan.Chen , PCR CLoning Protocols
http://regenerativereview.com
